Issu d’une famille de trois enfants, Jensen Ackles est le fils de l’acteur Alan Roger Ackles. Dès l’âge de 4 ans, ses parents lui font faire des séances photos pour des publicités et des catalogues. Mais Jensen Ackles arrête cette activités de mannequinat vers l’âge de 16 ans car las des moqueries de ses camarades.
En 1996, il obtient son bac au lycée Lloyd V Berkner de Richardson au Texas. Jensen est sportif, il joue au Base-ball et à la Crosse car il se destine à une carrière dans la médecine sportive. Mais en participant à une pièce de théâtre au lycée, il décide finalement de devenir acteur et de prendre des cours d’art dramatique.
Jensen part pour Los Angeles et souhaite réussir rapidement car ses parents lui ont donné six mois pour parvenir à être acteur avant de reprendre ses études. Il commence par de petits rôles dans quelques séries comme : Mr Rhodes, Wishbone, 7 à la maison où Sweet Valley High.
Finalement il décroche un rôle récurent dans la célèbre série « Des jours et des vies » jusqu’en 2000, puis change de registre avec « Dark Angel » dans le rôle de Ben et de son clone jusqu’à l’arrêt de la série. Jensen enchaîne ensuite avec la série « Dawson’s Creek » et « Still Life ».
Il rate son audition pour le rôle de Clark Kent dans la série Smallville, mais obtient un autre rôle, celui de Jason Teague.
C’est en le voyant que les créateurs de la série « Supernatural » ont pensé à lui pour l’un des rôles principaux. Les séries « Smallville » et « supernatural » étant produites par la même chaîne, il ne fut pas difficile de l’extraire de l’une pour l’intégrer dans l’autre.